近日，德国马克斯·普朗克陆地微生物所博士和所在团队设计出一条人工二氧化碳固定途径，并将其命名为 THETA 循环。
图 | 罗姗姗（来源：）
研究中，他们不仅在体外环境中构建和优化了这一循环，更是将其以模块化的方式引入大肠杆菌之中，标志着在活细胞中构建高度正交的复杂人工固碳途径迈出了第一步。
据了解，THETA 循环可被用于构建体外二氧化碳转化平台，从而将二氧化碳转化为多种有用化学品比如生物燃料、生物材料以及高附加值化学品等。
同时，THETA 循环还有潜力将大肠杆菌转化为自养型微生物，从而构建具有超自然固碳能力的细胞工厂。
日前，相关论文以《构建和模块化植入 THETA 循环以实现合成二氧化碳固定》（）为题发在 Nature Catalysis[1]。
是第一作者兼共同通讯，德国马克斯·普朗克陆地微生物所托比亚斯·埃尔布（）担任共同通讯作者。
图 | 相关论文（来源：Nature Catalysis）
评审专家表示：“这项工作为合成生物学和二氧化碳固定相关的环境生物学领域做出了重大贡献。”
Nature Catalysis 同期刊登的评论文章评价道：“本次成果为在活细胞中构建复杂的、正交的二氧化碳固定途径提供了路线图......有潜力将二氧化碳转化为生物燃料、生物塑料、药品前体、以及特种化学品等高附加值化合物。”
（来源：Nature Catalysis）
二氧化碳研究之“未知数”
面对当前的气候危机，开发高效的二氧化碳捕集技术、固定和封存技术已经成为当务之急。
在自然界中，植物、藻类和自养型微生物通过固碳途径，利用光能或化学能将二氧化碳转换为有机物。
尽管人类目前已经发现七条自然固碳途径，但相比理论可行的所有固碳途径，这仅仅是一小部分。
对于自然选择来说，它更偏向于支持生长而非一味追求固碳效率。因此，许多在理论上具备更高效率的固碳途径，并未出现在大自然之中。
合成生物学的发展，让人们可以自由地组合各种酶、生化反应和反应机理，从而设计出能够超越自然的人工二氧化碳固定途径。然而，这条路上依然充满挑战，特别是在拥有复杂生化环境的细胞内实现这些途径。
虽然已有研究通过表达少量基因，可以将自然二氧化碳固定途径引入大肠杆菌等模型生物。
但是，对于含有众多正交代谢产物和反应的人工二氧化碳固定途径能否在体内实现？这依然是一个未知数。
（来源：Nature Catalysis）
人工固碳循环迈出体内实现第一步
因此，和同事将本次研究的目标定为：设计一条具有广泛应用前景的高效人工固碳途径。
固碳途径的核心是固碳步骤，因此选择性能优异的固碳酶尤为重要。研究中，他们选用两种来自细菌的高效固碳酶。基于这些固碳酶，他们设计了反应途径模块，进一步地将模块组装成循环。
期间，该团队也考虑了终产物、以及中间代谢物的性能。对于终产物来说，它应该具有转化为多种有用化学品的潜力。而中间代谢物应该包含中心代谢产物，以便将循环植入细胞内。
基于此，他们设计了 THETA 循环。通过使用自然界中性能最优异的两种固碳酶，让 THETA 循环能够将二氧化碳转化为中心代谢产物——乙酰辅酶 A。并且在这种循环之中，还包含着多种中心代谢产物。
完成循环设计之后，课题组先是在体外环境中构建 THETA 循环，即在相对适宜的缓冲液环境中，利用纯化之后的酶和辅酶来实现反应。
此外，通过添加校对反应、以及换用高活性酶这两种方法，副反应和某些酶活性不足等瓶颈问题也被加以攻克。
随后，其又利用机器学习、以及实验室自动化操作，找到了更优的反应条件。整个优化过程将乙酰辅酶 A 的产量提高将近两个数量级。
具体来说，他们在优化 THETA 循环的体外运行时，使用了机器学习的方法。体外 THETA 循环可被视为是一个包含 34 个变量的系统，这些变量包括酶浓度、缓冲液浓度、pH 值和辅酶浓度等。
研究中，课题组利用自研的机器学习模型 METIS，以产量为优化目标，每轮测试 30 个不同的反应条件。
在不同条件之下，34 个参数的取值也各不相同。于是他们采用自动化取样设备 Echo 设定不同的反应条件。
这时课题组将不同条件下的产量数据反馈给模型，这时模型就能学习参数与产量的关系，从而预测下一轮的 30 个测试条件。
经过九轮的迭代优化，他们找到一个较优的反应条件，其产量比优化前提高 4-5 倍。同时，利用 METIS 还可以分析各种参数变化对于产量的影响，从而了解上述系统的潜在瓶颈。
接着，他们开始将 THETA 循环引入细胞环境，并选择大肠杆菌作为宿主。鉴于 THETA 循环的复杂性，他们将其拆分为三个模块，然后分别导入大肠杆菌之中。
但是他们在体内构建模块三时遇到了最大的困难。尽管尝试了多种方法，筛选菌株依旧无法利用该模块进行生长。
尽管基于生长选择的方法是体内构建代谢途径时广泛使用的方法，但是这种方法无法揭示细胞内部的具体变化。
这时，代谢途径的体内构建就像在“黑箱”中操作。于是，他们转而尝试打开“黑箱”，看看细胞内引入新代谢途径之后究竟发生了什么？
后来，通过代谢组学分析的方法，他们了解到大肠杆菌中会发生两步反应，从而消耗模块三的关键中间代谢产物。
这两步反应虽然阻碍了模块的构建，但是他们意识到也能将其用于绕过模块中的限速步，从而将障碍转化为优势。
据此，他们调整了上述模块，在大肠杆菌中构建了“酸旁路”的模块三。由此可见，深入了解“黑箱”之内的情况，有利于构建细胞内的代谢途径。而且，代谢途径的可塑性非常高，通过合理的设计，有可能让不利因素转变为优势。
利用生长选择筛选和同位素标记的方法，他们证明这三个模块在细胞之内都能有效运行，这标志着在细胞内构建高度正交且复杂的人工固碳循环迈出了第一步。
（来源：Nature Catalysis）
如何确保 100% 实现 THETA 循环？
那么，在实验条件下如何确保完全地实现 THETA 循环？
要想在体外环境中实现 THETA 循环，首先要拥有适当的酶，来催化循环中的反应。这些酶应该具有高活性、高稳定性和高度特异性。如果酶的性能不够理想，可以通过酶工程或重新设计反应途径等方法解决。
除此之外，还需要确定适宜的反应条件，比如缓冲液浓度、pH 值、辅酶浓度等，并确保辅酶的有效再生，从而驱动循环的运行。
而在体外循环建立之后，如何确保 THETA 循环在细菌体内也能成功运行？表示，为了确保 THETA 循环在细菌体内有效运行，必须保证循环中的各个反应能在细胞内顺利进行。
同时，对于新引入的循环来说，它必须与细胞固有的代谢网络、代谢负荷和基因调控之间达到微妙的平衡。
此外，还必须为细胞提供充足的能量，从而驱动循环的运行。鉴于细胞内部复杂的生化环境，要想实现这些目标颇具挑战。
这不仅需要合理的设计，还需大量的定向进化，利用细胞的突变和生长选择，来达成人工固碳循环在细胞内的实现。
那么在产量和效率上，体内循环和体外循环有差异吗？答案是肯定的。
对于产量来说，它依赖于酶的浓度、以及具体的反应条件，而体内环境和体外环境有着显著不同。
在体外环境下可更精确地控制酶浓度和反应条件，从而更容易对产量表现进行优化。
对于效率来说，无论是体外环境还是体内环境，都可以通过一定的优化，来让 THETA 循环的实际效率接近理论效率。一般来说，通过抑制副反应、以及减少竞争代谢途径等方法，将有助于提高循环的实际效率。
人工固碳循环和电催化二氧化碳还原有何不同？
你可能会好奇，本次所构建的人工固碳循环，和电催化二氧化碳还原有何异同？
事实上，人工固碳循环和电催化二氧化碳还原，都是在温和反应条件之下，将二氧化碳转化为有用化学品。因此，这两种方法都是清洁绿色的二氧化碳转化方式。
当进行人工固碳循环的时候，生物催化反应需要使用生物酶，因此催化的专一性很强，并且在催化 C-C 键形成上拥有一定优势。
另外得益于生物反应的模块化特点，可以从生物构建分子出发合成多种生物大分子，因此在多碳化合物的生产选择性和种类上，人工固碳循环有着一定的优越性，但还需要解决能量的持续供应问题。
电催化二氧化碳还原，在近些年发展得十分迅速。然而，目前大多数研究集中在将二氧化碳转化为一碳化合物，仍然面临着电催化过电势高、多碳化合物产物选择性低等问题。但是，在实现碳中和目标的路上，它们都是值得大力发展的关键技术。
“如能将这两者加以有机结合，例如利用电能为人工生物固碳循环供能，通过生物催化将电还原产生的一碳化合物，进一步利用生物催化转化为生物材料、生物燃料和高附加值化学品，就能最大化地利用各自的技术优势，从而为实现碳中和贡献更多力量。”表示。
而对于她和所在团队来说，其远期目标在于希望实现 THETA 循环在大肠杆菌中的运行，将其转变为能让二氧化碳作为唯一碳源的自养型微生物。
假如可以实现，就能建立一个既能固定二氧化碳、又能进行基因改造的细胞工厂。目前，他们正专注于优化 THETA 循环的模块，并计划将三个模块整合到筛选菌株之中。
参考资料：
1.Luo，S.， Diehl， C.， He， H. et al. Construction and modular implementation of the THETA cycle for synthetic CO2 fixation. Nat Catal 6， 1228–1240 (2023). https://doi.org/10.1038/s41929-023-01079-z
运营/排版：何晨龙
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